|
|
Regulace posttranslačních modifikací histonů a její využití v diagnostice a léčbě rakoviny plic
Marada, Kryštof ; Janoštiak, Radoslav (vedoucí práce) ; Červená, Klára (oponent)
Cílem této bakalářské práce je shrnutí epigenetických mechanismů, tedy metylace DNA, nekódující RNA a posttranslační modifikace histonů. V rámci posttranslačních modifikací histonů je zde popsáno jejich pět v současnosti nejprozkoumanějších typů, tedy acetylace, metylace, fosforylace, ubiquitinylace a sumoylace. Dále obsahuje shrnutí modifikujících enzymů, jejichž funkcí je přidávání a odstraňování těchto epigenetických složek. A také popsání proteinů, které tyto složky rozpoznávají. Následuje popis toho, jak se epigenetické procesy podílejí na průběhu rakoviny. Zbylá část práce je věnována rakovině plic, jejím nejčastějším příčinám, jakými metodami se v současnosti léčí a jak by se při její léčbě dali využít posttranslační modifikace histonů. Většina této kapitoly je věnována inhibitorům histon deacetyláz, protože tyto inhibitory představují potenciál jakožto nová složka léčby rakoviny plic, což z nich také dělá cíl mnoha výzkumů.
|
|
|
Vliv indolových alkaloidů na vybrané buněčné linie a DNA struktury
Dobrovolná, Michaela ; Hoová, Julie (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
G-kvadruplexy (G4) jsou sekundární struktury DNA tvořené seskupením guaninů, u kterých bylo prokázáno, že hrají roli v mnoha biologických funkcích, včetně regulace načasování replikace a potlačení exprese onkogenů. V této práci byly testovány čtyři rostlinné alkaloidy (harmin, harman, harmalin a brucin), jako potenciální G4 ligandy, které by mohly regulovat, indukovat, nebo konvertovat různé topologie G4. Dále byl studován jejich vliv na buněčné linie kožních fibroblastů HDF164 a karcinomu prsu MCF-7, u kterých byl prokázán na dávce závislý mechanismus inhibice růstu. U harminu, harmalinu a brucinu byla potvrzena interakce s paralelním G4 promotoru protoonkogenu c-Myc, u harminu, harmanu a harmalinu s hybridním G4 telomerické DNA. Navíc byla ověřena schopnost testovaných sloučenin interagovat s dvouřetězcovou DNA telecího brzlíku (ctDNA) pomocí UV-Vis absorpční spektroskopie. Metylační test ukázal, že DNA buněk MCF 7 ošetřených harminem a brucinem byla hypermetyovaná.
|
|
|
Kvalita spermatu ovlivňuje oplození u sladkovodních ryb
CHENG, Yu
Krátkodobé uchování spermatu v líhňařské praxi ryb je hojně využívanou technikou při umělém oplození, a to díky své výhodnosti, nízké ceně a praktičnosti. V kapitole 2 byly porovnány tři techniky inkubace jiker s cílem ověřit jednoduchou a účinnou metodu inkubace oplozených jiker u jesetera malého. Bylo sledováno procento oplození, neurulace, líhnutí embryí a larev tak, aby bylo možné porovnat účinky inkubačních systémů umístění Petriho misek 1) v nádrži líhně, 2) na stole v malém inkubačním boxu v klimatizované místnosti nebo 3) v termostatickém inkubačním boxu. Mezi těmito systémy inkubace jiker v Petriho miskách nebyly zjištěny rozdíly. Získané zkušenosti umožnily využít tento způsob inkubace v Petriho miskách u dalších druhů ryb, jako jsou kapr a zebřička. V kapitole 3 byla pozornost věnována procesům aktivace a oplození jiker. U jesetera malého, jakožto modelového druhu jeseterovitých ryb bylo zásadní standardizovat postupy oplození. Byla zkoumána úroveň neurulace a míra líhnutí (%) embryí. Bylo použito více násobné ošetření spermií při oplození s různým gradientem počtu spermií a objemem aktivačního roztoku pro oplození jiker a dále stanoven minimální počet spermií při optimálním objemu aktivační vody. Pokusy s umělým oplozením ukázaly, že k úspěšnému oplození postačuje celkem 50 000 spermií v 8 ml, resp. 32 ml aktivační vody. Bylo zjištěno, že velmi nízká koncentrace 100 - 1 300 spermií v ml aktivační vody může zabezpečit účinné oplodnění při použití kvalitního spermatu. Kapitola 4 zkoumala management spermií, včetně zablokování spontánního pohybu spermií, složení umělé semenné plazmy a použití přirozené semenné plazmy z dobrého spermatu. U zebřičky se zkoumala optimalizace oplození pomocí různých metod, poměr spermie : vajíčko a minimální koncentrace spermií na ml aktivačního roztoku. Výsledky ukázaly, že extendor E400 je účinný při uchování spermií zebřiček; zkumavka s přesně definovaným množstvím 6 000 000 spermií zebřičky v extendoru E400 na 100 vajíček a 100 ?l aktivačního roztoku se ukázala být úspěšnější než použití Petriho misky. Spermie sumce velkého lze uchovat v imobilizačním roztoku po dobu až 1 týdne, přičemž si spermie zachovávají dostatečnou kvalitu pro úspěšné oplodnění a získání normálního plůdku. Bylo zjištěno, že spermie jesetera malého špatné kvality lze revitalizovat inkubací v semenné plazmě spermatu s dobrou motilitou spermií. Dosažené výsledky pomáhají stanovit metodu uchování spermií in vitro a postupy oplození u sladkovodních ryb. Kapitola 5, aktivační roztok je jedním z klíčových faktorů zabezpečující výkonnost spermiím během oplodnění. Byly použity různé aktivační roztoky, aby se otestovala praktická účinnost použití v líhni se spermiemi, které byly stárnoucí, ale zředěné v umělé semenné plazmě. Z rozsáhlých pokusů s umělým oplodněním vyplynulo, že oplození a lepivosti byly vysoké (78-87 %) po týdenním uchování spermií v umělé semenné plazmě kapra v aktivačních roztocích jako voda z líhně a roztok Perchec. Výsledky nabídly praktický základ pro další využití stárnoucího spermatu v líhni. V kapitole 6 této studie jsme použili stárnoucí sperma kapra obecného k vyhodnocení pohyblivosti a kinematiky spermií. Bylo provedeno přesné hodnocení životaschopnosti spermií, osmolality a pH semenné plazmy, aby bylo možné vyhodnotit vliv krátkodobého uchování in vitro na spermie. Byla také provedena analýza metylace DNA založená na celo genomovém bisulfitovém sekvenování k odhalení molekulárních změn stárnoucích spermií. Výsledky ukázaly, že stárnutí u spermií kapra obecného má značně negativní dopad na jejich výkonnost a na úspěšnost umělého oplodnění. Kromě toho se úroveň metylace v cytosin-fosfát-guaninových místech výrazně zvýšila u spermií 24 hodin po odběru spermatu ve srovnání se skupinou čerstvých spermií, ale poté se výrazně snížila v 96 hodinách po odběru spermatu. Výsledky přispěly k výzkumu fenotypu a funkčních změn spermií kapra obecného a k pochopení molekulárních změn při uchování spermií.
|
|
|
Metylace DNA řízená malými RNA u Arabidopsis thaliana
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Rozdílná transkripční aktivita různých oblastí genomu je zajišťována epigenetickými modifikacemi, mezi které patří metylace DNA, úprava N-koncových aminokyselin histonů a změny v zastoupení histonových variant. RNA interference je regulační proces, při kterém dochází prostřednictvím malých RNA odvozených z exogenních či endogenních sekvencí k posttrankripčnímu nebo transkripčnímu umlčení těchto sekvencí. 24-nukleotidové siRNA, tvořící část malých RNA, řídí de novo metylaci a spoluúčastní se udržování metylace DNA (RNA-directed DNA methylation; RdDM), která se podílí na transkripčním umlčení heterochromatinu a transponovatelných elementů, vyskytujících se u rostlin ve velkém množství. Pro krytosemenné je také charakteristická přítomnost RNA polymeráz IV a V účastnících se v této dráze, které byly poprvé objeveny v genomu Arabidopsis thaliana, jež se stala hlavní modelovou rostlinou i pro studium RdDM. Polymeráza IV přepisuje prekurzory siRNA; siRNA jsou následně asociované s AGO4 proteiny a navádějí metylační enzymy na cílové sekvence prostřednictvím komplementarity s transkripty polymerázy V.
|
|
|
Epigenetická regulace genů pro HLA II. třídy ve vztahu ke stárnutí organismu
Říhová, Adéla ; Kotrbová - Kozak, Anna Katarzyna (vedoucí práce) ; Slavčev, Antonij (oponent)
Úvod: Glykoproteiny hlavního histokompatibilního sytému (MHC) jsou nezastupitelnými spoluúčastníky regulace imunitní odpovědi a udržování imunitní homeostázy. Regulace jejich exprese hraje důležitou roli v adaptivní imunitní odpovědi. V poslední době je velmi zkoumaným mechanismem této regulace metylace DNA v regulačních oblastech, které jsou klíčové pro dostupnost DNA transkripčním faktorům. Stárnutí organismů je mimo jiné spojováno se změnami v metylaci DNA. Zvýšená predispozice k imunosenescenci ve stáří by mohla být následkem právě změn v metylačním stavu regulačních oblastí genů MHC II. třídy. Cíle: Cílem této práce je analýza metylačního stavu regulační oblasti genu DQB1 a porovnání rozdílu mezi generacemi a jednotlivými alelami. Dále je porovnána úroveň exprese mRNA genu DQB1 mezi generacemi a mezi jednotlivými alelami. Metody: Z krve dárců tří různých věkových skupin byly izolovány DNA a RNA. DNA byla genotypizována a modifikována bisulfitovou konverzí. Dále byly amplifikovány regulační oblasti genů DQB1 a byly klonovány do bakterií. Pozitivní klony byly selektovány a podrobeny metylační analýze. RNA byla přepsána do cDNA pomocí reverzní transkripce a její relativní úroveň exprese byla určena pomocí kvantitativní PCR. Výsledky: Mezigenerační analýza intronu 1 ukázala statisticky významný...
|
|
|
Epigenetické regulace u autoimunitních onemocnění se zaměřením na revmatoidní artritidu
Horková, Veronika ; Daňková, Pavlína (vedoucí práce) ; Hušáková, Markéta (oponent)
Přesná příčina revmatoidní artritidy, jako i dalších autoimunitních onemocnění ještě stále není identifikována. V posledních dvaceti letech epigenetika ukázala novou tvář immunitního systému. Dědičné změny mimo sekvence DNA poskytují další komponentu hrající roli v autoimunitě. Metylace DNA, modifikace histonů - proteinů, kolem kterých je DNA obmotána, či interference malých sekvencí RNA - microRNA, všechny tyto mechanismy ovlivňují genovou expresi a tím umožňují zvýšenou produkci prozánětlivých faktorů vedoucích k autoimunitním reakcím. Kromě toho, geny regulující apoptózu jsou často cílem epigenetickách modifikací. Tyto mechanismy nejenže poskytují další úroveň imunitní obrany, ale poskytují také vysvětlení pro vyšší náchylnost žen k autoimunitním nemocím i vliv prostředí na patogenezi těchto nemocí.
|
|
|
Role genu pro FTO v genetické determinaci "civilizačních" onemocnění
Dlouhá, Dana ; Hubáček, Jaroslav (vedoucí práce) ; Černá, Marie (oponent) ; Rossmeislová, Lenka (oponent)
Obezita je rizikovým faktorem rozvoje mnoha civilizačních onemocnění. Mezi tato onemocnění s nejvyšší úmrtností patří kardiovaskulární onemocnění (KVO), diabetes mellitus 2. typu (DM2), některá nádorová onemocnění a onemocnění pohybového aparátu. Jedním z genetických rizikových faktorů determinujících tělesnou hmotnost je gen pro FTO ("fat mass and obesity associated protein"). Úkolem této disertační práce bylo zjistit, 1) zda výskyt rizikových alel u vybraných polymorfismů koreluje s BMI u české populace, 2) analyzovat souvislost mezi variantou v 1. intronu v genu pro FTO a rizikem infarktu myokardu/ akutního koronárního syndromu (IM/ AKS), 3) renálním selháním (ESRD) a 4) výskytem kolorektálního karcinomu (CRC). Polymorfismy rs17817449 (1. intron) a rs17818902 (3. intron) jsme analyzovali metodami PCR-RFLP či RT PCR. Potvrdili jsme souvislost varianty v prvním, ale ne ve třetím intronu s BMI u české kontrolní populace. Intervenční studie ukázaly souvislost se změnami BMI (pouze rs178117449) u dětí, ale ne u obézních žen. U pacientů s AKS jsme nalezli korelaci mezi G alelou a zvýšeným rizikem tohoto onemocnění (OR 1,49). U pacientů s ESRD jsme detekovali souvislost mezi výskytem stejné alely a rozvojem onemocnění (OR 1,37). U pacientů s CRC jsme souvislost s výskytem rizikové alely u varianty v 1....
|
|
|
Studium epigenetických regulací HLA genů II. třídy v rámci příbuzenských vztahů.
Chmel, Martin ; Černá, Marie (vedoucí práce) ; Urbanová, Jana (oponent)
Úvod: V současné postgenomické době představuje studium epigenetických regulací jeden z nástrojů pro porozumění funkci genů. Epigenetické regulace mohou přímo řídit časovou a prostorovou aktivitu genů či jejich umlčení. Molekulární podstata těchto regulací spočívá v modifikaci bází DNA, remodelaci chromatinu a RNA interferenci. Zároveň tyto mechanismy vykazují vlastní způsob přenosu dědičné informace do dalších generací nazývaný epigenetikcá dědičnost. V rámci mnoha chorob byla jako příčina prokázána deregulace epigenetické informace určitých genů. Z tohoto důvodu se jeví studium epigenomu HLA genů jako zvláště důležité, neboť tyto geny hrají zásadní roli v regulaci imunitního systému. Cíle: Cílem této práce je vytvořit popis epigenetických modifikací v rámci rodin. Jedná se o analýzu histonových modifikací a metylace DNA v promotorovém úseku genu HLA DQA1. Cílem bylo rovněž srovnat rozdíly v epigenetických modifikacích mezi alelami a také srovnání rozdílů v daných modifikacích mezi generacemi. Získané výsledky budou porovnány s analýzou míry exprese genu HLA DQA1. Metody: Z odebrané periferní krve dárců byly izolovány DNA, RNA a leukocyty. DNA byla použita ke genotypizaci. Další část vzorků DNA byla konvertována bisulfitovou metodou a posléze sekvenována. Ze získaných dat byla provedena analýza...
|
|
|
Genetic and epigenetic mechanisms (and their cooperation) in the leukemogenesis of acute myeloid leukemia in adults.
Šestáková, Šárka ; Šálek, Cyril (vedoucí práce) ; Vymetálková, Veronika (oponent) ; Kubričanová Žaliová, Markéta (oponent)
Akutní myeloidní leukémie (AML) je maligní hematopoetické onemocnění, které je vysoce heterogenní zejména díky své klonální podstatě. Rozvoj sekvenování nové generace umožnil důkladně prozkoumat mutační pozadí AML. Bylo zjištěno, že asi 44 % pacientů má mutaci v některém z genů ovlivňujících metylaci DNA. Od té doby již mnoho autorů publikovalo prognostický význam určitých změn v metylaci DNA u AML. Žádný z těchto poznatků však nebyl převeden do klinické praxe, především kvůli značné rozdílnosti jednotlivých studií. Cílem této práce bylo jednak hlouběji prozkoumat změny v metylaci DNA u pacientů se specifickým genetickým pozadím a pokusit se nalézt jejich prognostický význam. Dále jsme chtěli vyvinout nový způsob pro komplexní zhodnocení změn v metylaci DNA, u kterých byl již význam pro prognózu AML pacientů prokázán. V našem prvním projektu jsme zkoumali celkové DNA metylační, hydroxymetylační a expresní profily AML pacientů s mutacemi v DNMT3A nebo IDH1/2 nebo v obou těchto genech. Zjistili jsme, že každá mutace je spojena s charakteristickými změnami v hydroxy-/metylaci DNA, které ovšem nejsou zcela reflektovány změnami v genové expresi. Pacienti s mutacemi v obou genech se vyznačovali směsným DNA hydroxy-/metylačním profilem, který byl nejpodobnější vzorkům zdravých dárců. Dále jsme nalezli...
|
|
|
Dynamics and variability of induced transgene silencing in tobacco cell line BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Pečinka, Aleš (oponent) ; Lafon Placette, Clément (oponent)
RNA interference (RNAi) je důležitým mechanismem regulace genové exprese u rostlin. RNAi u rostlin je spouštěna přítomností dvouvláknové RNA (dsRNA), která je následně zpracována na malé RNA (sRNA) o délce 21-24 nt. Malé RNA po navázání na protein Argonaut (AGO) jsou schopné rozeznat cílovou molekulu na základě sekvenční komplementarity. Pokud je cílem mRNA, může ji AGO rozštěpit, nebo může blokovat translaci, což vede k posttranskripčnímu umlčení (PTGS). Pokud je cílem DNA, tak může navodit její metylaci, což vede k transkripčnímu umlčení (TGS), pokud dojde k metylaci v promotoru. Jednotlivé komponenty RNAi jsou celkem dobře popsány, ale méně je známo o vlivu odlišných typů dsRNA prekursorů na dynamiku RNAi. Ke studiu těchto aspektů RNAi jsme využili tabákovou buněčnou linii BY-2 s reportérovým genem pro GFP cíleným silencery s inducibilní expresí. Fungování silencerů bylo založeno na třech základních způsobech tvorby dsRNA: transkripcí antisense GFP (AS), GFP bez terminátoru (UT) a GFP v invertované repetici (IR). Tyto tři silencery spouštěly PTGS, čtvrtý silencer byla IR cílící na CaMV 35S promotor a spouštějící TGS. To nám umožnilo studovat RNAi od její iniciace, přes plné umlčení až po obnovení exprese při vysazení induktoru - vše relativně snadno analyzovatelné díky vysoce homogennímu...
|
host ::
RSS.